Untersuchungen zur Beteiligung der Preseniline an den molekularen Mechanismen der Amyloid-ß Entstehung

ZusammenfassungMorbus Alzheimer ist eine progressive, neurodegenerative Erkrankung, die weltweit die häufigste Form der Demenz darstellt und im mittleren bis späten Lebensabschnitt auftritt. Die neuropathologischen Merkmale beinhalten das Auftreten von extrazellulären Ablagerungen aus fibrillogenem Aß42 Peptiden in senilen Plaques und intraneuronalen Akkumulationen von hyperphosphoryliertem Tau in sogenannten neurofibrillären Bündeln. Obwohl die meisten Alzheimer Fälle sporadisch und Alters-assoziiert auftreten, gibt es eine autosomal dominant vererbte Form (FAD; Familial Alzheimer Disease), die schon in einem frühen Lebensabschnitt (ab 28 Jahren) ausbrechen kann. Diese aggressive Alzheimer Form wird durch Mutationen im Amyloid-Precursor-Protein-Gen (APP) oder den Presenilin-Genen (PS-1 und PS-2) ausgelöst. Die Presenilin (PS) Proteine sind entscheidend an der Entstehung von Aß beteiligt. So erhöhen FAD-assoziierte Mutationen in PS-1 und PS-2 die Bildung von Aß42. Außerdem verhindern sowohl homozygote PS-1 Null-Mutationen (PS-1-/-) in transgenen Mäusen, als auch dominant negative PS-1 Mutationen in Kulturzellen die Ab Bildung. Diese Belege sprechen für die zur Zeit favorisierte Amyloid Hypothese, in der die toxische Wirkung des Aß-Peptides in der Entstehung der Alzheimer Erkrankung eine zentrale Rolle einnimmt. Die y-Sekretase ist eine Protease, deren Aktivität für die Entstehung von Ab aus dem Vorläuferprotein APP essentiell ist. Damit bildet sie einen möglichen Ansatzpunkt, um grundlegend in den Prozeß der Ab Bildung einzugreifen. Die y-Sekretase ist allerdings noch nicht identifiziert oder kloniert. Es gibt Hinweise, daß die Preseniline y-Sekretase Aktivität besitzen könnten. Diese Theorie ist bis heute jedoch nicht eindeutig belegt. In dieser Arbeit sollten die molekularen Mechanismen der Ab Entstehung und insbesondere die Beteiligung der Preseniline an diesem Prozeß untersucht werden. Dazu wurde zunächst die subzelluläre Verteilung der endogenen Preseniline analysiert. Es konnte erstmalig ein Unterschied in der subzellulären Verteilung zwischen PS-1 und PS-2 festgestellt werden. PS-1 war vorwiegend im ER lokalisiert, wogegen PS-2 stark im Golgi-Apparat angereichert war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde nach möglichen Interaktionen der Preseniline mit C-terminalen APP Fragmenten gesucht, die die Substrate der y-Sekretase darstellen. Es konnte gezeigt werden, daß die Preseniline mit einem 21 kDa großen C-terminalen APP Fragment interagieren. Dabei band die Mutante-Form der Preseniline mehr C-terminales APP Fragment als die Wildtyp-Form. Weiterhin wurde ein zellfreies System zur indirekten Bestimmung der y-Sekretase Aktivität etabliert. Mit Hilfe dieses Systems wird es möglich, Inhibitoren der y-Sekretase zu identifizieren. Die Spezifität des zellfreien Testsystems konnte dadurch deutlich gemacht werden, daß das PS-1, das schon in Zellkultur als essentielle Proteinkomponente zur Entstehung von Aß beschrieben wurde, auch in diesem zellfreien y-Sekretase System notwendig war. Allgemeine Proteaseinhibitoren, die alle bekannten Proteasemechanismen abdeckten, zeigten keinen Einfluß auf die de novo Bildung von Aß. Es konnte festgestellt werden, daß neben der y-Sekretase als Aß produzierende Protease auch Aß abbauende Proteasen vorlagen. Das pH-Optimum der y-Sekretase wurde im neutralen Bereich festgestellt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die y-Sekretase eine transmembrane oder zumindest membranassoziierte Protease ist, die keine cytosolischen Komponenten benötigt.

Relevanz der Methioninoxidation aus evolutionärer Sicht und im akuten oxidativen Stressmodell der Alzheimerschen Krankheit

Im Laufe der Evolution müssen Sauerstoff-metabolisierende Organismen eine Reihe von Anpassungen entwickelt haben, um in der zytotoxischen oxidativen Umgebung der sauerstoff-haltigen Erdatmosphäre überleben zu können. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten vergleichenden Analysen mitochondrial kodierter und kern-kodierter Proteome mehrerer hundert Spezies haben ergeben, dass die Evolution eines alternativen genetischen Codes in Mitochondrien eine moderne Adaptation in diesem Sinne war. Viele aerobe Tiere und Pilze dekodieren in Abweichung vom genetischen Standard-Code das Codon AUA als Methionin. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese Spezies dadurch eine massive Akkumulation der sehr leicht oxidierbaren Aminosäure Methionin in ihren Atmungskettenkomplexen erreichen, die generell ein bevorzugtes Ziel reaktiver Sauerstoffspezies sind. Der gewonnene Befund lässt sich widerspruchsfrei nur unter Annahme einer antioxidativen Wirkung dieser Aminosäure erklären, wie sie erstmals 1996 von R. Levine anhand von Oxidationsmessungen in Modellproteinen postuliert worden war. In der vorliegenden Arbeit wird diese Hypothese nun direkt mittels neuartiger Modellsubstanzen in lebenden Zellen bestätigt. Die durchgeführten bioinformatischen Analysen und zellbiologischen Experimente belegen, dass kollektive Proteinveränderungen die Triebkraft für die Evolution abweichender genetischer Codes sein können.rnDie Bedeutung von oxidativem Stress wurde darüber hinaus auch im Referenzrahmen einer akuten oxidativen Schädigung im Einzelorganismus untersucht. Da oxidativer Stress in der Pathogenese altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimerschen Krankheit prominent involviert zu sein scheint, wurden die Auswirkungungen von Umwelt-induziertem oxidativem Stress auf den histopathologischen Verlauf in einem transgenen Modell der Alzheimerschen Krankheit in vivo untersucht. Dabei wurden transgene Mäuse des Modells APP23 im Rahmen von Fütterungsversuchen einer lebenslangen Defizienz der Antioxidantien Selen oder Vitamin E ausgesetzt. Während die Selenoproteinexpression durch die selendefiziente Diät gewebespezifisch reduziert wurde, ergaben sich keine Anzeichen eines beschleunigten Auftretens pathologischer Marker wie amyloider Plaques oder Neurodegeneration. Es war vielmehr ein unerwarteter Trend hinsichtlich einer geringeren Plaquebelastung in Vitamin E-defizienten Alzheimermäusen zu erkennen. Auch wenn diese Daten aufgrund einer geringen Versuchstiergruppengröße nur mit Vorsicht interpretiert werden dürfen, so scheint doch ein Mangel an essentiellen antioxidativen Nährstoffen die Progression in einem anerkannten Alzheimermodell nicht negativ zu beeinflussen.rn